ความปรารถนาในตัว เอ็มเจ (เคิร์สเตน ดันสท์) ที่มีมานานของ ปีเตอร์ ปาร์คเกอร์ (โทบีย์ แมกไกวร์) ยิ่งทวีความรุนแรงมากขึ้น เมื่อเขาต้องต่อสู้กับแรงกระตุ้นที่จะละทิ้งชีวิตลับ ๆ ของเขา และเพื่อประกาศความรักที่เขามีต่อเธอด้วย ขณะเดียวกัน เอ็มเจยังคงใช้ชีวิตเดินหน้าต่อไป เธอหันไปทำงานด้านการแสดง และมีผู้ชายคนใหม่ในชีวิต ส่วนมิตรภาพระหว่างปีเตอร์กับเพื่อนสนิท แฮร์รี่ ออสบอร์น (เจมส์ ฟรังโก้) ต้องตกอยู่ในเงามืด เมื่อแฮร์รี่ยิ่งเพิ่มความพยาบาทในตัวสไปเดอร์แมน ซึ่งเขาถือว่าเป็นผู้ที่ต้องรับผิดชอบ ต่อการตายของพ่อของเขามากขึ้นทุกวัน ชีวิตของปีเตอร์ยิ่งซับซ้อนยุ่งยากมากขึ้น เมื่อเขาต้องพบกับศัตรูรายใหม่ที่ทรงพลังอย่าง ‘ด็อก อ็อค’ ถึงตรงนี้ ปีเตอร์ต้องเรียนรู้ ที่จะยอมรับในชะตากรรมและพันธนาการ ที่มาพร้อมอำนาจพิเศษในฐานะซูเปอร์ฮีโร่ เพื่อหยุดคนบ้ารายนี้จากแผนการที่ชั่วร้าย
